公司新聞
上周，“袁來如此”專欄根據已發(fā)表的文獻資料，對臨床免疫原性的評估作初步介紹（袁來如此 | 蛋白質和多肽藥物臨床免疫原性的評估和報告（1_上）：基本概念和臨床相關性 ）。本期將延續(xù)上期內容，重點就確定ADA免疫反應的特征以及ADA臨床相關性分析等方面進行探討。 本期內容是《袁來如此》專欄的最后一期，感謝各位讀者對本欄目的關注與支持！未來博濟醫(yī)藥將繼續(xù)在相關學術領域深耕，適時推出科普學術專欄，敬請期待！ 確定ADA免疫反應的特征 對臨床免疫原性解釋的一個基本指標是ADA在該研究中或在可比較的所有同類研究中的發(fā)生率。經過驗證的ADA測試方法將樣品表征為ADA陽性和陰性。此外，當使用易受藥物干擾的檢測方法時，建議將含有藥物干擾的樣品劃定為第三類—ADA-無結論。早先的文獻中最初建議，此類樣品應報告為“陰性，但可能有藥物干擾”，其目的是想表達：此類樣本的ADA狀況未確定或測試結果可能不準確。然而，新的生物分析技術和樣品預處理步驟（例如，酸分離），經過仔細優(yōu)化和驗證，是能夠提供準確結果的，這應該會幫助減少ADA無結論的樣品。ADA的生物分析策略和技術細節(jié)不在本文討論的范圍之內，但后續(xù)"生物分析注意事項"中簡短地討論了可能影響免疫原性結果的方法學問題。 首先，需要根據體外測試方法得出的數據對受試者的ADA狀態(tài)進行分類，建議根據以下定義對受試者的每個樣本進行分類（“樣本ADA狀態(tài)”）： • ADA 陽性樣本：當在樣本中檢測到 ADA ，該樣本被視為陽性。 • ADA 陰性樣本：當未檢測到 ADA 且同一樣本中藥物不存在或即便存在，但具有已被證明不會干擾ADA檢測的水平，則該樣本被視為陰性。 • ADA 無結論樣本：當未檢測到 ADA ，但樣本中存在藥物，其水平可能干擾 ADA 的檢測方法，則不能無可爭議地確認該樣本為陰性，最好將其歸類為 ADA-無結論樣本。 • 不可測評樣品：樣品由于樣品量不足、處理不當或樣品收集、處理、儲存等錯誤而無法測試 ADA 狀態(tài)（“未檢測的樣品”）的樣品。 需要對上述定義作出以下澄清：“檢測到”意味著藥物分子特定的ADA得到確認（confirmed）。此外，測定的“藥物耐受性”（不干擾ADA檢測方法的最高藥物濃度）并不是一個絕對數值，因為每個受試者之間會有所不同（由于ADA引起免疫反應的親合性不同）。眾所周知，人體的免疫反應因受試者而異，并且檢測中所使用的陽性對照品的性質也不能外推到臨床樣本中去。但是，目前實用的方法也只是使用一個或多個ADA陽性對照品來開發(fā)檢測方法。這樣開發(fā)的方法能夠耐受高于預期最高的血液藥物濃度，而不至于受到藥物的干擾。 因此，制藥廠家可以考慮采取保守的方法，例如將ADA檢測方法的藥物耐受水平提高到ADA樣本中預期藥物濃度峰值的兩倍。同時，在可行的情況下，在預期血藥濃度最低（低谷濃度，trough concentrations）或處于藥物“洗凈washed out”階段來采集ADA樣品，這樣的取樣策略可以更準確地檢測ADA。值得注意的是，用“邊界陽性（borderline positive）”一詞來描述具有位于檢測切點（assay cut point）上方的陽性結果的樣本（經確認存在ADA）是不合適的，這些是陽性樣本，其滴度至少等于檢測方法所需的最小稀釋度（MRD）。 其次，根據樣本的ADA狀態(tài)，建議使用以下定義確定每個受試者的治療-免疫原性顯現的狀態(tài)（受試者ADA狀態(tài)）： •可評估受試者：該受試者在治療或后續(xù)觀察期間至少獲取了一個適合做ADA檢測的樣本（有可報告結果）。只有可評估受試者會用于計算治療引起ADA的發(fā)生率。建議在適合檢測抗體的時間點采集樣本，如"采樣"部分所述。 •不可評估受試者：在治療或后續(xù)觀察期間，服用藥物后一個樣本也沒有采集到（或者沒有可報告的結果）的受試者。然而，雖然該受試者被排除在治療-免疫原性顯現的分析之外，但如果基線樣本有可報告的結果，則該受試者應納入預先存在ADA的人數中。另一方面，如果一個不可評估受試者的所有樣本都無法評估或沒有可報告的結果，那么該受試者就不參與任何免疫原性分析。 •ADA陽性受試者：在治療或后續(xù)觀察期間的任何時間取樣，至少有一個治療引起或治療增強的 ADA 陽性的樣本。 •ADA陰性受試者：在治療或后續(xù)觀察期間的任何時間取樣，沒有一個治療引起或治療增強的 ADA 陽性的樣本。 •ADA無結論受試者：不能無可辯駁地歸類為 ADA 陰性的受試者。為此類別建立一個單一的定義是不可行的：因為對于不同類別的產品和不同情況，存在多種可能的原因導致這種狀況。因此，在開發(fā)生物藥時，應將藥物的免疫原性風險的概況、先前使用該藥物的經驗、同類藥物的標簽信息或相關文獻和/或與監(jiān)管機構的討論等，全面納入考慮和評估，以便對ADA無結論受試者定義一個合用（fit-for-purpose）的類別。 例如： a.盡管在受試者使用某個高風險藥物治療期間（包括隨訪觀察期）觀察到一些ADA陰性樣本，但其他多個樣本都屬于無結論樣本，以致無法對受試者的ADA狀態(tài)得出明確結論。 b.盡管在受試者使用低風險藥物治療期間（包括隨訪觀察期）的所有樣本都是ADA陰性，但最后一個可評估樣本是個無結論樣本。因此，保守的說法就是這個受試者是ADA無結論受試者。當然，如果不這樣判定，就應當提出合理的科學證據。 將對ADA檢測呈陰性，但能檢測到藥物（或其濃度在該方法的藥耐限量之上）的樣本判定為ADA-無結論樣本可能是一個存在爭議的問題。普遍持有的觀點是：ADA樣本檢測的結果應“按原樣”報告，即僅有陽性或陰性這兩種結果，這些結果可根據其它測試（如PK和PD）的結果加以審視；如果對ADA陰性結果的懷疑有進一步的證據（基于其它檢測），則需要進一步解釋。但是，此方法假定進行其他適當的測試，即它們能夠容忍ADA的存在，并且有足夠的敏感性和選擇性，因而足以證明ADA的效果。 可能出現的另一個有爭議的問題是：ADA無結論受試者是否應包括在具有ADA結果（報告為ADA陽性或陰性的比例）的受試者總數（分母）中。 另一種觀點認為，ADA無結論受試者不應包括在分母中，因為“藥物不耐受”的ADA檢測方法會報告假陰性數據。另一方面，如果ADA無結論受試者只占被評估受試者的一小部分，免疫原性風險被認為較低，或因為無法完全地確信所測定的“藥物耐受性”（因其不是一個很準確的限度），則包括這些受試者是可以接受的。例如，在某些腫瘤藥物研究中，包括 ADA-無結論受試者可能是合理的，這些研究通常使用高劑量的藥物（導致藥物的血清低谷濃度的水平較高），藥物洗凈期（washout periods）也常常無法實現。 如果是這樣做的話，就應該在藥品標簽上清楚地解釋相關注意事項。無論做何決策，都應該對 ADA 檢測方法與其藥物容忍限度有良好的理解，使用多個 ADA 陽性對照，使用來自正交的檢測方法或技術的支持性數據，與相關醫(yī)藥監(jiān)管機構進行協商。 最后，值得注意的是，在臨床研究設計中，一個重要的考慮因素是建立一個采樣策略，即在預期藥物濃度最低（低谷濃度）或消除階段（藥物洗出）時采集樣本，以增加準確檢測到和正確報告 ADA 的可能性。在將受試者及其樣本分成上述“ADA狀態(tài)”的類別之后，建議從不同角度對組合數據集進行詳細評估。如果樣本大小允許，也應該按每個相關變量，如：劑量、給藥頻率、給藥途徑、給藥次數、藥物暴露天數（每天注射一次或多次藥物）、同時用藥（特別是免疫調節(jié)劑）等等，進行分析。ADA臨床相關性分析 評估ADA陽性樣本的臨床相關性的第一步是以不同的方式將數據可視化?？梢暦治龅某潭葘⑷Q于藥物所處的開發(fā)階段、樣本數量和ADA發(fā)生率（ADA陽性受試者越多，數據的統(tǒng)計相關性或對“趨勢”的判斷更可能是有價值的）。因此，數據分析的類型和范圍應以合理的科學判斷與相關醫(yī)藥監(jiān)管機構的協商為出發(fā)點和動力。一些有價值的ADA 屬性分析類型如下: • 預先存在的ADA、滴度和增強（boosting）： -基線ADA陽性受試者占其基線樣本的受試者總數（經ADA測試，有可報告的結果）的百分比； -基線ADA陽性樣本的滴度范圍（中位和四分位數[IQR]范圍）； -服用生物藥后ADA陽性基線受試者中ADA陽性受試者顯著增加的百分比：即在初始給藥后，采集到的任何一個樣本具有ADA滴度，并且該滴度以科學上合理的幅度，如4倍或9倍，超越基線滴度。 • ADA發(fā)生率和滴度： -ADA總體發(fā)生率：治療增強和治療引起ADA陽性受試者的總和，除以可評估受試者的總數，而得出的百分比。不包括給藥后沒有任何樣本供評估，基線陽性的受試者。 -治療引起的ADA發(fā)生率：治療引起ADA陽性受試者總數，除以可評估的，基線ADA陰性的受試者總數，而得出的百分比。此外，需要報告此組受試者滴度的峰值和范圍（中位數、IQR）。 •中和性ADA：如果適用的話，按上文所述分析報告預先存在的NAb、增強和發(fā)生率。如果ADA在所有受試者中都是中和性ADA，則無需作單獨的分析。 •ADA動力學：ADA出現的時機及其持續(xù)時間對于臨床醫(yī)生監(jiān)測治療的進展非常有用?？贵w的持續(xù)性在幾個病例中顯示與臨床效應相關聯。 對藥物開發(fā)人員而言，關于ADA動力學知識有助于優(yōu)化同一生物藥后續(xù)研究中的采樣計劃，以及作為藥物上市后藥物警戒計劃的一部分，助力ADA監(jiān)測計劃的優(yōu)化、風險的管理和緩解。 ADA動力學的圖像表示是最有用的。例如，圖1中說明了ADA開始和ADA持續(xù)時間的雙變量圖；圖2中所示為瞬時態(tài)與持續(xù)性ADA頻率圖。當ADA陽性受試者數量較多（例如≥20），并且研究持續(xù)時間足夠長，足以識別其發(fā)育后持久性抗體（例如≥1年）時，這些類型的圖表蘊含的信息最豐富。 圖1.治療引起的ADA動力學: 發(fā)生和持續(xù)時間。ADA陽性結果持續(xù)時間與ADA發(fā)生時間的示意圖。垂直和水平網格線繪制在分布的四分位數處：這有助于確定ADA的持續(xù)性或瞬時性是否與在患者中觀察到ADA的時間相關。為了保證評估的準確性，只有那些ADA始發(fā)時間是上次訪問前至少16周，或者在上次訪問時或之前是ADA陰性的患者，才應列入此圖。在解釋此示意圖時，應牢記在較晚的ADA始發(fā)時間的最大持續(xù)時間將按比例減少。圖中的符號可以指示所選擇的變量（本例中是劑量），臨床效應，如：對療效的影響（例如：是，否，和研究中斷），不良反應（例如：是，否，和研究中斷）等。 當樣本量足夠大時，還建議對結果進行更多的統(tǒng)計描述。這種客觀的方法可以防止由于主觀偏見而曲解結果。但值得注意的是，對于樣本量大小的評估應根據具體情況判斷，也要取決于臨床研究的設計。建議采用以下計算方法： （a）ADA的始發(fā)（Onset）：指在研究中初次給藥到發(fā)現第一例治療引起ADA的時間段。使用實際經過的時間是計算該時間段的理想選擇，不過使用最初設定的研究時間段也是可行的。計算“ADA 出現的時間中位值（median time to ADAdevelopment）”和四分位數 Q1 和 Q3，可以分別用來解釋50%、25%和75%的ADA陽性受試者的ADA始發(fā)時間。分析ADA始發(fā)相關的其他參數可以是：“到ADA始發(fā)的給藥次數"或 "到ADA始發(fā)的藥物暴露天數”。 （b）ADA的持續(xù)時間：指藥物引起的ADA的壽命。計算和報告誘導發(fā)生的ADA響應的中位持續(xù)時間和IQR，對于評估其與臨床效果的相關性，是最客觀的方法。但粗略地將 ADA 分類為瞬時性與持續(xù)性的方法占主導地位。雖然沒有必要使用此類術語進行分類，但在應用這些術語時，使用統(tǒng)一定義就變得非常重要了。因為天然（內源性）的人類IgG1，IgG2和IgG4的半衰期大約在21-25天左右，五個半衰期大約等于16周。如果ADA只被藥物誘導產生，并且從未被重新刺激或增強（一種"瞬時態(tài)"抗體），它將受人體的天然清除機制的約束。因此，ADA預計將在五個半衰期之后被完全清除（實際上只剩下微不足道的3%）。因此，可以用此現象區(qū)分瞬時性（血清返還sero-reverting）與持續(xù)性ADA，并建議用以下方法來評估ADA的持續(xù)時間: • 瞬時性 ADA 響應： –藥物治療引起的ADA在治療或后續(xù)觀察期間只在一個采樣時間點檢測到（不包括最后一個采樣時間點，除非在之后被證明無法檢測到），否則應視為持續(xù)性的，或： –藥物治療引起的ADA在治療期間（包括隨訪期，如果有的話）有兩個或兩個以上采樣時間點被檢測到，其中第一個和最后一個ADA陽性樣本（無論中間有任何陰性樣本）是小于16周的時間段間隔，并且受試者在最后一個采樣時間點是ADA陰性。 • 持續(xù)性 ADA 響應： –藥物治療引起的ADA在治療期間（包括隨訪期）有兩個或兩個以上采樣時間點被檢測到，其中第一個和最后一個ADA陽性樣本（無論中間有任何陰性樣本）間隔有16周或更長，或： –藥物治療引起的ADA發(fā)生率僅在治療研究期的最后一個采樣時間點，或者與上一個ADA陰性的間隔不到16周的采樣時間點。雖然很少見，但如果IgG3或IgA的ADA在研究人群中占主導地位，則應用5周（而不是16周）的時間段來修改瞬時性和持續(xù)性ADA的定義。這是因為IgG3和IgA的半衰期比其他IgG短（IgG3為7天，IgM和IgA為5天）。 請注意，治療增強的ADA被排除在ADA動力學分析之外，因為這種類型的免疫反應在機制上有所不同。在預先存在的ADA非常普遍的情況下，單獨描述增強ADA的動力學可能很有用。這時，無需將ADA響應分為瞬時性（transient）和持續(xù)性響應。計算ADA的中位持續(xù)時間和四分位數（Q1和Q3）后就可以分別描述50%、25%和75%的ADA陽性受試者的ADA持續(xù)時間。四分位數方法可以更好地闡明ADA持續(xù)時間與臨床效應之間的關系（如果有的話）。最后一點，將瞬時性和持續(xù)性抗體分別定義為在研究結束前消失和在最后研究時間點仍然存在的抗體，是不太合適的，這是因為瞬時性和持續(xù)性ADA的定義將取決于臨床研究的長度，而并非ADA實際持續(xù)的時間。如果使用這樣的定義，較長的臨床研究會將ADA的性質偏頗地判斷為"瞬時性抗體"。 • NAb 發(fā)生率和動力學： 當研究結果表明：受試者可以根據他們是否擁有NAb與non-NAb 而分組時，可以運用上文所述方式，分別詳細考察每個組NAb的發(fā)生率和動力學。 • 交叉反應性： 當生物藥物分子與內源性蛋白（全部或部分）相同或幾乎相同時，評估ADA與內源性蛋白的交叉反應性非常重要，因為人們越來越擔心這種ADA可能導致以內源性蛋白質耗盡為特征的自身免疫性綜合征。將具有交叉反應性的ADA和對藥物分子的ADA滴度和動力學進行比較會有助于評估相關疾病的惡化。 圖2.治療引起的ADA發(fā)生動力學: 一個研究實例中的瞬時和持續(xù)ADA免疫反應的發(fā)展。每一點表示在所示發(fā)病時間出現ADA的受試者的百分比，其持續(xù)時間可能是短暫的或持久的。在此示例中，10%的受試者有 2個月的ADA始發(fā)時間，其中4%具有瞬時性ADA響應，6%具有持續(xù)性 ADA響應。類似的，在6個月的ADA始發(fā)時間，0.5%有瞬態(tài)ADA響應，5.5%有持續(xù)的ADA響應。該圖的橫軸也可以使用劑量。 可以使用替代方法描述這些ADA的屬性。但是需注意的是，主觀性的術語應該避免，因為它們可能被錯誤地解釋為暗示與臨床效應某種程度的關聯性。例如，ADA陽性人群的滴度可以報告為中位數和四分位數范圍（IQR），但不宜使用諸如“高”或“低”等詞語，因為人們可能錯誤地認為高滴度的抗體與臨床效應相關（即引起不良事件），而低滴度的抗體則不會（即良性）。 圖3.ADA滴度動力學。研究中隨時間變化的這種滴度圖有助于確定ADA水平在治療過程中是否隨時間而變化。每個框圖表示滴度范圍、Q1、中位數（Q2）、Q3，不包括異常值（星標）。 ADA數據可以酌情以表格、文本或圖像等形式顯示。其中，以表格形式提供原始數據可以幫助監(jiān)管機構能夠進行獨立的分析，以驗證所提交的結果。當在表格中提供樣本分析結果時，最好包括：受試者識別號、臨床站點識別號（姓名或編號）、計劃的隨訪或給藥訪問（預定時間點）、給藥劑量/頻率、樣本采集日期（實際時間點）、測定的藥物血清濃度、樣本ADA的狀態(tài)和滴度、中和能力狀態(tài)等。ADA陽性受試者數量很少的研究可能會限制某些數據分析的進行。總結與前瞻 此文為本《蛋白質和多肽藥物臨床免疫原性的評估和報告》系列的第一篇，包含相關定義和術語、ADA免疫反應的特點以及其臨床相關性分析。后續(xù)文章將涉及ADA狀態(tài)與PK/PD，臨床安全性和療效的關系。 特別聲明本文如有疏漏和誤讀相關指南和數據的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經發(fā)表學術期刊、官方網絡報道等公開渠道，不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。 參 考 文 獻 1. 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2021-09-13
本期《袁來如此》為系列文章《蛋白質和多肽藥物臨床免疫原性的評估和報告》的第一篇，旨在根據已發(fā)表的文獻資料，對臨床免疫原性的評估作初步介紹，包含相關定義和術語、ADA免疫反應的特點及其臨床相關性分析。 由于內容篇幅較長，本文將采取上下篇形式進行推送，《袁來如此》系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術專欄，敬請垂注！ 評估生物藥的免疫原性是開發(fā)生物藥過程中的一個重大關注點，因為它會影響生物藥的安全性和有效性。迄今為止，文獻中對藥品免疫原性的描述各不相同，這一方面是因為學者們對藥品免疫原性的理解程度隨時間在不斷加深，另一方面要歸結為該領域專業(yè)詞匯不斷演變造成了一定的混亂。慶幸的是，隨著近年來業(yè)界對于評估藥品免疫原性所需的數據日益達成了共識，相對統(tǒng)一的表述也逐步形成。 描述抗藥物抗體（ADA）的發(fā)生率、動力學和強度、中和能力、與內源性分子或其他上市生物藥的交叉反應以及相關的臨床影響，可加強對使用這些生物藥的患者的護理。為此，需要對描述和分析臨床免疫原性數據的術語和定義、呈現數據的方法、ADA的出現/發(fā)展與藥代動力學、療效和安全性的關聯等評估免疫原性的臨床相關性所必需的工具做一個梳理。導論 蛋白質藥物（也稱為生物制劑、生物藥或生物制品）和多肽具有誘發(fā)免疫原性的潛力，本文中稱此類別的藥物為“生物藥”。在傳統(tǒng)意義上，多肽雖然不被認為是生物制劑或蛋白質藥物，但仍可能具有類似于蛋白質的免疫原性。美國和歐洲監(jiān)管機構目前將多肽區(qū)分為重組（生物）實體與合成（化學）實體，要求分別提交不同的生物制劑許可證申請（BLA）/營銷授權申請（MAA）。 具有免疫原性的藥物能造成的臨床后果各不相同，沒有任何臨床效果或者嚴重、危及生命的反應都有可能發(fā)生?？顾幬锟贵w（ADA）可引起輸液反應（infusion reactions）、過敏反應（anaphylaxis）以及免疫復合物（immune complex）介導的疾病，ADA還導致次級治療失?。疮熜У膿p失），在極少數情況下，還可能引起更嚴重的不良事件，如缺乏綜合征（deficiency syndromes），例如血小板減少癥（thrombocytopenia）和純紅細胞發(fā)育不全（pure red cell aplasia）。因此，ADA是一個涉及生物藥的安全性和長期療效的醫(yī)學難題，在臨床研究期間評估患者ADA的出現和發(fā)展十分關鍵，而且并不能單純只是以臨床癥狀為關注點，需要密切關注和評估ADA的產生和發(fā)展的機制性問題。因此，闡明ADA響應及其臨床特點與其造成的相關后果，借以指導醫(yī)療實踐，是至關重要的。 近年來行業(yè)界已經開發(fā)出各種方法來降低蛋白分子的免疫原性，包括使用全人類蛋白質序列、修改已知或預期的免疫原顯性表位、使用哺乳動物細胞系統(tǒng)生產藥物、實施先進的生產方法和分析表征技術。但是，人類免疫系統(tǒng)仍然可以感知來自生物藥的“異質性/非自我性”或“危險信號/自身壓力”等因素，從而對生物藥產生特定的免疫反應。 事實上，大多數已批準上市的生物藥物都是免疫原，ADA的發(fā)生率可以達到90%以上。更重要的是，ADA及其臨床后遺癥的發(fā)生率在同類產品之間以及患者群體之間可能有很大差異，這妨礙了對免疫原性的預測。所以，我們必須在臨床研究時加以監(jiān)測。這種差異可能是由于使用不同的生物分析方法、數據解釋方法，以及大量產品特異和患者特異等因素所造成的。而使這一問題更加復雜的是，用于收集、分析和呈現免疫原性結果的術語和方法缺乏一致性和標準化。 生物藥標簽或處方會在不同程度上描述臨床免疫原性，但往往只提到在關鍵的臨床Ⅲ期研究中ADA和中和性抗體（NAb）的總體發(fā)生率。這些有限的信息并不足以真正告知醫(yī)生和患者在臨床實踐中使用該藥物的真正收益與風險，對ADA相關事件缺乏充分和一致的描述可能導致臨床醫(yī)生錯誤地管理患者的用藥。 為了給患者提供最佳的治療計劃，有關免疫原性的具體信息可在如下情況下讓醫(yī)生受益：在啟動治療方案時的安全性考量，在可接受的安全性前提下如何維持治療效果，以及提供在患者中出現ADA時如何應對的選項。示例包括：在初次給藥或間歇性重新給藥時出現過敏反應的風險；在存在ADA的情況下，以實現治療效果為目標的給藥策略，以及在何種情況下需要停止治療，或者評估切換到其他同類產品或具有不同作用機制的產品的后果。因此，產品標簽需要描述ADA的發(fā)生率、程度、始發(fā)時間、持續(xù)時間、中和能力、與內源性分子或其他上市生物藥的交叉反應，以及其臨床相關閾值，以便在臨床上優(yōu)化使用該生物藥治病的療程。 因此，本文將探討與生物藥的免疫原性相關的，常用于產品免疫原性描述的術語和定義，數據分析和呈現方法，以及臨床醫(yī)生評估免疫原性的臨床相關性的指南，并且對臨床研究中評估ADA時所用的采樣模式以及相應結果的解釋和呈現提出了具體建議。由于藥物開發(fā)階段或藥物警戒目標以及對特定風險的具體評估不同，相關數據的分析和解釋也會有所不同，因此，上述建議將作為一般方法加以推薦，以增進對免疫原性的理解，但這并非意味著能夠以其取代當前的監(jiān)管指導文件、與衛(wèi)生機構協商的結果、合理的科學判斷。定義和術語 在免疫原性研究中的常見定義或術語匯集如下： •生物藥：此術語指使用生物技術生產出的治療性蛋白藥物，包括單克隆抗體（mAbs）和多肽、一些血漿衍生產品（例如，凝固因子替代產品）和使用天然方法生產的蛋白質（例如，治療性酶和毒素），但不包括：寡核苷酸、細胞產品和疫苗。生物藥包括多肽，無論是用何種方法，化學合成的或生物系統(tǒng)表達生產的，也無論目前監(jiān)管機構對生物藥是如何定義的。 •抗藥物抗體（Anti-Drug Antibody，ADA）：能與生物藥反應，結合的抗體，包括用藥前存在的宿主抗體（能與目前使用的生物藥發(fā)生交叉反應的宿主抗體，稱為“基線ADA”）。它包括中和性的和非中性的ADA。等同于ADA的其他術語包括：抗治療抗體（Anti-Therapeutic Antibody，ATA），抗產物抗體（Anti-Product Antibody，APA），或抗生物抗體（Anti-Biologic Antibody，ABA）。 •藥物結合抗體（Binding ADA）：所有ADA本質上都是“結合”抗體。因為，它們都經體外測試的方法確定與生物藥分子結合。這個定義不涉及其在人體體內活性的相關性，即這種結合是否產生臨床效應。通常，濫用此術語的情況是僅將其應用于非中和性抗體，而事實上，中和性抗體也屬于藥物結合抗體這一大類別。 •中和性ADA（NAb，Neutralizing ADA）：通過體外試驗或動物生物學方法確定的，能夠抑制或減少生物藥分子藥理活性的ADA，無論其人體臨床的相關性如何，即無論測試結果與受試者上的臨床效應是否有關。 •非中和性ADA（non-neutralizingantibody，non-NAb）：ADA與生物藥分子結合，但不抑制其藥理活性（經體外測試或基于動物的生物學方法測定），無論其人體臨床的相關性如何，即無論測試結果與受試者上的臨床效應是否有關。 •藥物維持性ADA響應：能降低生物藥體內清除率的ADA免疫響應，該生藥物的半衰期在其與此ADA結合的狀態(tài)比在其未結合的狀態(tài)要更長（通過統(tǒng)計學方法判斷的）。與ADA結合后的藥物可能有藥理活性（與非中和性ADA，即non-NAb結合時），也可能沒有藥理活性（與中和性ADA，即NAb結合時）。 •藥物清除性ADA響應：能增加藥物體內清除率的ADA（NAb或non-NAb）免疫響應（通過統(tǒng)計方法判斷），這里是ADA免疫響應（不是ADA本身）被視為“清除性”的。這個和上一個定義描述了ADA對生物藥分子造成的某種后果，即該生物藥體內清除率的變化。ADA對藥物清除率的影響涉及多層面的機制：循環(huán)中免疫復合物晶格（circulating immune complex lattice），補體結合，Fc受體結合等。一般來說，除了藥物的正常清除途徑外，ADA與生物藥分子形成的免疫復合物是由reticuloendothelial system清除的。由于免疫復合物的大小取決于抗原和抗體的濃度，在某些情況下，ADA可能只在超過一定滴度閾值的情況下才會增加藥物體內清除率。 •人抗鼠抗體（Human Anti-Murine Antibody，HAMA）：對存在于鼠源或人源化的mAb藥物分子上的鼠原表位的人類抗體。從字面上看，這個術語可以解釋為：對某個mAb藥物產生的ADA可能與其他含鼠序的抗體發(fā)生交叉反應。將含有鼠序的mAb藥物給予ADA陽性的患者可能會是一個問題。當未確認ADA與其他鼠源抗體有交叉反應時，建議避免用HAMA代表對鼠源抗體藥物的ADA。 •人抗嵌合體抗體（Human Anti-Chimeric Antibody，HACA）：人類對存在于嵌合體mAb藥物分子中非人類表位（通常是：人+另一物種，通常是小鼠）產生的抗體。從字面上看，這個術語可以解釋為ADA可能與其他嵌合體抗體發(fā)生交叉反應，給ADA陽性受試者服用其他嵌合物抗體藥物可能會是一個問題。當未確認ADA與其他嵌合體抗體發(fā)生交叉反應時，建議避免使用HACA代表對嵌合體mAb藥物的ADA。 •人抗人抗體（HAHA）：對存在于人源化的或完全人類的mAb藥物分子中的人/人源化的表位產生的ADA。從字面上看，這個術語可以解釋為該ADA可能與其他基于人類序列的抗體發(fā)生交叉反應。因此，給ADA陽性的受試者服用其他人類mAb藥物可能會是一個問題。當未確認ADA與其他基于人類序列的抗體發(fā)生交叉反應時，建議避免使用HAHA代表對人源或人mAb藥物的ADA。 •風濕因子（RF）：一種內源性免疫球蛋白，通常結合IgG的Fc部分。RF通常存在于患有自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L濕性關節(jié)炎）患者的血清中。風濕因子有時也會出現在其他疾病患者，甚至健康個人的血清中，并可能干擾ADA檢測方法。 •預先存在的ADA：指在治療前（或臨床研究開始之前），受試者體內存在的與生物藥反應的抗體。此術語與“基線ADA”類似，嚴格地用于代表治療開始前檢測到的與藥物反應的抗體，而不論這種反應的起因（即無論患者是否在過去接受同一藥物，或因接觸其他藥物/抗原后，所產生的能交叉反應的抗體）。 •治療引起的ADA：在服用生物藥之后產生的新ADA（血清轉化），即在沒有預先存在的ADA的受試者中，在最初服用藥物后的任何時間內形成的ADA。 •治療增強的ADA：預先存在的ADA，在服用生物藥后被提升到更高水平。即在初始服用藥物后的任何時間內，ADA的滴度以科學合理的倍數（如4倍或9倍）超出基線滴度。 •ADA流行率（prevalence:）：所有在任何時間點具有藥物反應抗體（包括預先存在的抗體）的受試者與可以評估的人群的比值。此術語與 ADA 發(fā)生率不同（見下文）。 •ADA發(fā)生率（incidence）：在研究期間發(fā)現有血清轉化或增強其先前存在的ADA的研究人群的比例。是“治療-出現ADA”的同義詞，ADA發(fā)生率為治療引起的和因治療增強了的ADA陽性受試者的總和與可以評估的人群的比值。術語“ADA比率（rate）”不應用于代表ADA發(fā)生率，因為“rate”通常意味著一個測量單位隨時間的變化，而"發(fā)生率"是測量單位與相關單位總群體的比值。此術語與 ADA 流行率不同（見上文）。 •滴度（titer）：樣本中ADA水平的準定量表達。通過采用基于連續(xù)倍比稀釋的測試方法，滴度被定義為樣品（包括MRD，最低稀釋度）產生陽性結果（即高于預定的“切點”值的結果）的最高稀釋倍數的倒數，例如，稀釋1/100=滴度為100。滴度也可以在用對數轉換后呈現。或者在切點值處，通過從稀釋曲線插入值，來推導滴度。臨床免疫原性的分析與報告 與預定的臨床研究策略（如：在關鍵臨床研究中設定的劑量）相關的綜合性的免疫原性分析策略和計劃對于闡明免疫原性數據的臨床相關性至關重要。 應當使用靈敏和驗證過的分析方法對ADA進行測試，并采用適當的策略來闡明免疫原性。在檢測到ADA之后，特別是在后期臨床研究中，需要評估ADA反應的強度（滴度）與其體外的中和能力。ADA的其他特征，如免疫球蛋白亞型（subclass）或等型（isotype）的測定、域映射（domain-mapping）、相對結合親和力、與內源性蛋白質的交叉反應性或ADA的補體激活能力，也可能需要評估，但這往往取決于對特定產品、特定臨床適應癥或某些基于風險評估的需要。 還可以根據動力學特性進一步描述ADA的屬性，即藥物暴露后，什么時候這些抗體最早出現（ADA的發(fā)生，onset）以及持續(xù)多長時間（ADA的持續(xù)時間，duration）。ADA的任何上述屬性和動力學特征都可能與其臨床效果相關。因此，臨床研究的ADA結果可以表述為：（a）ADA免疫反應的特征；（b）ADA與藥代動力學（PK）的關系，以及藥效動力學（PD）生物標志物的關系；（c）ADA與所測試藥物的臨床安全性和有效性的關系。 ADA的臨床后果可能從沒有明顯臨床效果到療效缺失（初級治療失敗）、療效損失（次級治療失敗）或因生物藥物暴露量改變而藥效增強、藥物不良反應（與給藥有關的全身或部位反應），以及嚴重的藥物不良反應（過敏和與內源性分子的交叉反應和中和相關的獨特的臨床問題）。因此，詳細考察ADA或其屬性與各種臨床后遺癥之間的任何關聯就變得非常重要。 一方面，清除性ADA的免疫反應（對PK的影響明顯）和非清除但是中和性的ADA響應（如低滴度的NAb對PD的明顯影響）可能會對臨床療效產生負面影響，但另一方面，ADA的存在并不一定排除ADA陽性患者使用該藥物，因為臨床藥效最終取決于ADA對PK和PD的影響程度。因此，ADA與PK/PD的關系是一個重要的附加考慮因素，但并不一定就會導致臨床上的不良后果。 特別聲明 本文如有疏漏和誤讀相關指南和數據的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經發(fā)表學術期刊、官方網絡報道等公開渠道，不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。 參 考 文 獻1. 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2021-09-07
今天下午（9月3日），CDE官網連發(fā)4份文件，涉及化學創(chuàng)新藥早期臨床研究、患者報告結局在藥物臨床研究中應用、藥物臨床試驗數據管理與統(tǒng)計、新冠肺炎新藥研發(fā)等多個領域。 化藥創(chuàng)新藥方面，CDE發(fā)布《化學藥創(chuàng)新藥臨床單次和多次給藥劑量遞增藥代動力學研究技術指導原則（征求意見稿）》，該文件共涵蓋前言、總體考慮、研究設計、數據分析、研究報告等5個方面，征求意見時間為1個月。文件合集 在患者報告結局在藥物臨床研究中應用領域，CDE發(fā)布了《患者報告結局在藥物臨床研究中應用的指導原則（征求意見稿）》，該文件共涉及引言，患者報告結局定義，患者報告結局測量量表的研發(fā)、翻譯、改進，患者報告結局測量量表的選擇與評價，臨床研究中使用患者報告結局的考慮，電子化患者報告結局，與審批機構溝通交流等7個方面，征求意見時間為1個月。文件合集 在藥物臨床試驗數據管理與統(tǒng)計方面，CDE發(fā)布了《藥物臨床試驗數據管理與統(tǒng)計分析計劃指導原則（征求意見稿）》，該文件共有前言、數據管理計劃、統(tǒng)計分析計劃、參考文獻4個部分組成，征求意見時間為1個月。文件合集 在新冠肺炎新藥研發(fā)方面，CDE出臺了《新型冠狀病毒肺炎抗病毒治療及預防新藥臨床試驗技術指導原則（試行）》（征求意見稿）。該文件共涵蓋了概述、早期臨床試驗、探索性臨床試驗、確證性臨床試驗等4個部分，征求意見時間為1個月。 文件合集關于博濟醫(yī)藥 臨床研究服務： 博濟醫(yī)藥擁有一支規(guī)模龐大、專業(yè)成熟的臨床研究隊伍，可提供包括醫(yī)學、項目管理、監(jiān)查、稽查、數據管理和統(tǒng)計分析、生物樣本檢測在內的臨床試驗全流程解決方案。截至2020年，博濟醫(yī)藥服務的客戶超1000家，完成800多項臨床試驗項目，助力客戶獲得新藥證書60多項、生產批件超過80項。擁有豐富的臨床試驗服務經驗，服務項目涵蓋臨床研究各個領域，在腫瘤、肝病、消化等創(chuàng)新藥領域擁有獨特的臨床服務體系。 博濟醫(yī)藥在全國設有40多個臨床監(jiān)查網點，與全國近600個臨床試驗機構展開合作，并運用ORACLE OC/RDC及CTMS系統(tǒng)，控制臨床數據采集的及時性、管理臨床試驗過程的規(guī)范性。
2021-09-03
?此前，“袁來如此”專欄根據已發(fā)表的文獻資料，對PK定量方法的設計作初步介紹（袁來如此 | 大分子生物分析概論（十四_上）：LBA定量分析雙特異性生物藥的挑戰(zhàn)）。本期將延續(xù)上期內容，重點就相關案例分析、復雜藥物分子的未來生物分析技術以及前景等方面進行探討。 “袁來如此”專欄系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術專欄，內容均為博濟醫(yī)藥藥物研究中心資深科學顧問袁智博士原創(chuàng)。 案例分析（Case studies） 以下案例研究是為了說明對于雙特異性分子而言，生物分析的獨特考慮，其適用于在藥物開發(fā)的不同階段設計和實施定量生物分析和PK評估。案例分析1：在非臨床研究中定量總和完整雙特異性藥物并評估ADA對PK的影響。 化合物X是一種基于支架的針對兩種細胞因子的雙特異性抗體。初步數據表明，這種特殊的支架產品平臺可以在非臨床物種中高頻率地誘導免疫原性。為了更好地解釋ADAs存在時的毒理學發(fā)現，生物分析小組決定開發(fā)兩種不同的PK方法來測定動物血清中的總藥物和完整藥物的濃度?？侾K方法是使用兩種抗體對支架的框架進行分析。完整的PK方法是使用一種靶向細胞因子作為捕獲試劑，另一種作為檢測試劑。可以觀察到，使用兩種PK方法分析相同的樣品產生的濃度與時間關系幾乎完全等同，除了在較晚的時間點之外，藥物濃度非常低的時候，即完整藥物濃度略低于總藥物濃度的時候。 在這些時間點觀察到的低濃度差異只發(fā)生在少數受試者上。因此，ADA和生物轉化（biotransformation）被認為是最可能的根本原因。需進行一項研究以確定這種差異的根本原因，如生物轉化誘導的不穩(wěn)定性，靶標干擾（target interference）和ADA干擾。為了驗證這種雙特異性分子的體內生物轉化，例如，蛋白質水解是否揭示了影響穩(wěn)定性的結構缺陷，故開發(fā)了兩種配體結合質譜(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)方法，使用抗人Fc免疫親和捕獲和靶目標捕獲，然后進行分層次的質譜分析。采用與ESI-MS相結合的納米級液相色譜法對非多種代謝產物進行了更高分辨率的分離和鑒定。 數據顯示，生物轉化的結果為陰性。ADA分析表明雙特異性分子比其母體藥物的ADA出現頻率更高。盡管隨后通過免疫原性表征，證實大多數ADAs并非中和性ADAs，但發(fā)現ADAs有助于快速地清除完整藥物。這些數據也可以解釋為當藥物濃度足夠低時，內源性細胞因子占據了特定的捕獲/檢測位點，即存在靶標干擾。結果表明，該藥物在體內結構穩(wěn)定。PK數據差異與完整藥物的不穩(wěn)定性無關，而更可能是由于ADAs高水平導致清除藥物的速度更快。案例分析2：一個F(ab’)2在體內生物轉化為兩個活性F(ab)單體的PK分析。 本案例研究涉及一個雙特異性F(ab’)2，由一個anti-VEGF arm和一個anti-Ang2 arm組成，用于玻璃體內注射（intravitreal administration）治療視網膜變性疾病，如濕性老年性黃斑變性和糖尿病性黃斑水腫。據報道，針對F(ab’)2抗體鉸鏈區(qū)的，先前存在的內源性抗體(PEA)存在于很大比例的人群中。在未接受藥物的食蟹猴和人血清樣本中，都證實了這一點。移除這些預先存在的內源性抗體的鉸鏈表位（hinge epitopes）使得該分子中只有單個二硫鍵將兩個fab結合在一起。 因此，注射入玻璃體（其含有glutathione作為抗氧化產品的一部分，以保證晶狀體的完整性）后，藥物分子生物轉化為individual Fabs，相關清除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃體的Fab (t1/2 約3天)或F(ab’)2 (t1/2 約3天)的清除率要大(未發(fā)表的觀察結果)。 備注：一般情況下，t1/2與清除率的關系如下，即半衰期還取決于藥物分布體積；如果假設分布體積恒定，則t1/2與清除率之間的關系是確定成反比的： 因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均存在于眼腔(玻璃體和水相之中)和系統(tǒng)循環(huán)之中。正如所預料的，嚙齒類動物脈絡膜新生血管模型（rodent choroidal neovascularization models）顯示，individual Fabs保留了生物活性。為了全面地描述活性藥物暴露量的特征，有必要定量這3種藥物形式。因此，開發(fā)并驗證了3種單獨的PK定量方法。此前有學者曾經考慮過使用一種總PK定量方法來測定所有這3種形式。但是，該分子是一個新穎結構，故有必要闡明其生物轉化的動力學，這對于描述該分子體內的行為是很重要的。 定量完整待測物的ELISA方法使用固定的（immobilized）重組蛋白Ang2捕獲待測物，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一個sequential sandwich格式。外加待測物的回收率實驗證明這種測試格式僅能夠特異性地檢測F(ab’)2，但檢測不到兩種Fab分子中的任何一個。定量兩個Fab分子的方法都采納類似的基本格式：使用各自的靶標-Ang2或靶標-VEGF，從樣本中捕獲Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重鏈和輕鏈(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP進行檢測。 值得注意的是，采用測定Fab的格式，也可以檢測到完整分子。盡管使用Fabs作為標準品（standards）和對照品（controls），在分析Fab時，也定量了完整F(ab’)2。此外，使用F(ab’)2和任何一個Fab的混合物，可以通過從完整分子（高特異性）的定量結果中減去Fab結果來定量另一個Fab。已經驗證了所有這些分析方法，并用于兔血清樣本的非臨床研究，也認證了這些方法可用于食蟹猴的血清和水/玻璃體/視網膜的萃取物中藥物的定量。血清定量分析的另一個挑戰(zhàn)是幾個ng/ml甚至更低的藥物濃度，這也是玻璃體腔生物藥給藥的一致特點：給藥量很小(通常是<1 mg/eye)；藥物在到達系統(tǒng)循環(huán)時，經歷了高倍數的稀釋。案例分析3：在非臨床研究中監(jiān)測體內雙特異性藥物生物轉化的總和活性（total and active）藥物的定量。 一個針對腫瘤適應癥的雙特異性單克隆抗體靶向兩個細胞表面的抗原，其藥理作用取決于單克隆抗體的兩個結合臂（both binding arms）的完整。然而，在體外生物物理表征過程中，在其中一個結合臂中發(fā)現了翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)的問題。但這種PTM，不能在不顯著損害生物活性的情況下，通過蛋白質工程而排除，因為在不穩(wěn)定的氨基酸上的點突變（point mutation）會完全破壞單抗與靶標的結合。此外，僅具有第二個結合臂功能的藥物變異體的累積，可能會屏蔽活性藥物結合第二個靶點，并可能在多次給藥后誘發(fā)毒性反應。 對該單抗體內生物轉化的特征進行研究是勢在必行的，如轉化的動力學和程度，這可以為進一步開發(fā)該單抗提供指導。隨后，使用與分子的Fc部分特異性結合的測試試劑開發(fā)了一個橋接格式的總藥物PK定量方法，輔之以一種活性藥物PK定量方法：即使用靶標蛋白作為PTM-liable functional domain的捕獲試劑，使用抗人Fc試劑作為檢測試劑。利用野生型和擁有點突變的藥物的混合比例，活性PK方法，在總藥物存在的情況下，能夠區(qū)分和準確測定活性藥物的百分比。之后，評估了該藥物分子在食蟹猴上的PK特性。使用了總和活性PK定量方法來測定研究樣本中總和活性藥物的濃度。實驗數據證實，體內樣品中的藥物出現了PTM，并且活性藥物濃度百分比隨時間而降低?；诮：头抡妫梢栽谂R床研究中減少劑量間隔來減輕活性藥物濃度的降低。非臨床研究結果有助于決定使用活性PK定量方法作為支持臨床研究的主要方法。而在FIH研究中，總PK定量方法可用于進一步描述無活性藥物變異體（inactive drug variants）潛在的累積及其對PK/PD和毒性的影響。復雜藥物分子的未來生物分析技術 如表1中所總結的，一般需要多種PK定量方法和ADA方法評估ADC和雙特異性抗體的基礎藥代動力學和免疫原性。分析方法數量的增加給樣本的收集、儲存、運輸、分析和分析方法的生命周期管理帶來了巨大的負擔。在某些情況下，由于樣本數量有限，根本不可能進行多次分析。對于增加的功能域和潛在的生物轉化，僅僅增加分析方法的數量以滿足生物分析需求似乎是一個直接的解決方案，但“兩點式two-point”結合方法（如夾心式LBA）并不適合評估具有多域（>3）構造的分子“完整性intactness”。盡管免疫捕獲（IC-）-LC-MS/MS方法在理論上可以識別來自多個功能域的特征肽，但有關“完整性”和功能的信息仍然缺失。因此，隨著復雜藥物模式（complex drug modalities）的生物轉化越來越受到的關注，定量LBA方法和（IC-）LC-MS/MS方法往往無法對潛在的生物轉化提供相關信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的雙特異性抗體的案例所表明的那樣，PK行為的意外不一致觸發(fā)了潛在生物轉化的嫌疑，進而就需要新的分析方法來進一步研究。表1.ADC和雙特異性抗體的PK定量方法（SCR，標準曲線范圍；ECL，電化學發(fā)光；N.A.，不適用）備注：表格中參考文獻的標注不適用。 因此，使用multiplexed PK/ADA方法以測定完整藥物、各種變構體（variants）和相關的ADA是非常需要的，同時，也對潛在的生物轉化提供相關信息。Multiplexed檢測方法已在聯合療法中有早期應用，但尚未看到對復雜藥物模式“biotransformation ready”的multiplexed測試方法，用以幫助評估復雜藥物的完整性，表征各種生物轉化，并測試對藥物/藥物變構體各部分的免疫反應。下文將簡單介紹對復雜藥物模式有希望的兩項生物分析技術：HR-MS定量分析完整蛋白質和毛細管Western Blot定量分析。HR-MS 定量分析完整蛋白質 與針對完整藥物分子中某個選定區(qū)域的LBA和LC-MS/MS技術相比，完整蛋白質的定量分析旨在將一個復雜的藥物分子作為一個整體來研究，這能夠揭示重要的高層次結構和生物轉化的相關信息。完整蛋白的LC-MS分析通常用作對生物轉化研究的定性分析。Murphy等人使用IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body雙特異性抗體上發(fā)現并鑒別了蛋白酶剪切掉的含有8個氨基酸的肽段。He等人利用高分辨率的QTOF-MS與IC-LC相結合，成功地在小鼠血漿中，鑒別了若干不同DARs的ADC和生物轉化了的變異體（biotransformed variants，由于增加/刪除了hexose, glutathione, cysteine以及l(fā)inker-drug）。近年來，HR-MS在靈敏度和質量分辨率方面的提高，逐漸使其在定量生物分析中得以有更廣泛的應用。 Jian等人建立了IC-LC-QTOF-MS的工作流程，用于小鼠血漿中人類mAbs的絕對定量。定量的下限（LLOQ）為1000ng/mL（20 ?L血漿樣品），并可降至250ng/mL，如果使用200?L樣品。在優(yōu)化其數據處理策略后，LLOQ降至50ng/mL。使用所述工作流程，Jian等人隨后展示了GLP1-Fc融合蛋白的定量；同時，在對小鼠的研究過程中，識別了該藥物的兩種主要蛋白酶降解產物。 Lanshoeft等人驗證了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量方法，并用于非臨床PK研究，該方法同時定量分析了大鼠血清中兩個人類IgG1。類似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一種ADC）及其主要的DAR物種，其定量下限值約為20ng/mL，線性動態(tài)范圍為5-100?g/mL。 另一個有趣的應用是最近Zhang等人報道的，在非變性LC條件下對native intact mAb進行的定量分析，這可能為使用LC-HR-MS技術以multiplex的方式建立結合（bound）/未結合（unbound）PK定量方法以及其它各種功能域PK的定量方法提供了機會。毛細管Western Blot定量分析方法 毛細管Western blot，也稱為毛細管納米免疫測定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商Protein Simple(San Jose, CA)商業(yè)化的Simple Western system，是指毛細管電泳免疫測定系統(tǒng)，它提供基于蛋白質大小和電荷的分離格式。與在分離和檢測之前進行配體結合的IC-LC-MS技術不同，Western blot首先分離蛋白質，然后使用配體結合作為檢測方法。因此，它能夠使用multiplexed immunoassay，同時檢測完整的蛋白質及其生物轉化的產物，并對變異的各種功能域進行表征。 目前，毛細管Western Blot定量分析在蛋白質藥物的PK研究中應用仍然有限。Li等人在小鼠研究中驗證了無濃縮的PK方法，以定量小鼠血漿中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重組蛋白（約55kDa），其LLOQ為20ng/mL。Anti-FLAG tag抗體在immunoblot步驟中用作初級抗體。研究發(fā)現，只需以1:100至1:500的比例稀釋樣品，即可消除基質中高豐度蛋白的干擾。 此外，Kodani等人使用capillary western blot檢測到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗體，表明其在抗藥物抗體（ADA）檢測方面的潛在應用。重組HCV蛋白首先在毛細管中分離和固定。稀釋的人類血清隨后在毛細管中孵育，使抗HCV抗體與固定的抗原結合。這一步驟之后，使用抗人類IgG-HRP抗體再進行第二次孵育。在70個特表征良好的人血清樣本的檢測中，該方法與另一種市售的抗HCV抗體測試方法的相關性良好。結論 為了解決雙特異性分子開發(fā)過程中所需的生物分析支持，本文討論了在開發(fā)這些藥物分子的PK分析策略時一些獨特的考慮。本文提出的策略和方法可以應用于雙特異性分子和其它多域大分子藥物，這需要對特定的藥物分子其作用機制（MOA）和潛在的靶標生物學，以及評估PK/PD的所需要的數據有全面的了解。 大分子生物分析行業(yè)需要新的定量分析技術來開發(fā)multiplexed PK定量方法，以便定量復雜模式的藥物及其生物轉化產物。用于完整蛋白質分析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot技術擁有很大應用前景，因其multiplexibility和提供目標待測物的多維信息（如分子量等電點和域功能/domain functionality）的能力。在過去幾年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量靈敏度有了顯著改善，盡管這些技術仍需要進一步改善，以獲得更廣泛的接受。當前HR-MS系統(tǒng)的一般操作相對簡單，但HR-MS（以及capillary Western blot）的數據分析、解釋和驗證，從監(jiān)管的角度看，還需要進一步明確。 從理想的和雄心勃勃的角度思考，最好將PK/PD/免疫原性/生物轉化的生物分析整合到一個分析測試方法之中，以減少藥物開發(fā)所需的資源，并促進在同一組患者樣本中全面闡明藥物的PK/PD行為。設計和開發(fā)這樣的定量分析的方法，對每一種生物藥結構都是獨特的，需要一種徹底的“適合其用途”的方法及其確認（confirmation）。為雙（多）特異性分子開發(fā)可靠、穩(wěn)健和可重現的PK分析方法是非常具有挑戰(zhàn)性的，因為多種因素會影響準確（accurate）而有意義（meaningful）的濃度測定值。未來生物分析行業(yè)和監(jiān)管機構對指導定量分析這些高度復雜的生物（蛋白）藥的最佳做法的討論和意見，將會極具價值。未來前景 隨著生物分析方法的特異性、選擇性和靈敏度的不斷提高，更準確（accurate）和更精密（precise）的測定雙特異性抗體濃度和評估其在生物樣品中的免疫原性將成為可能。預計雙特異性和多特異性生物藥的數量和種類將繼續(xù)擴大，這將促進新的生物分析方法的開發(fā)，以適應這些分子的結構復雜性和MOAs。 當然，目前的方法將被用于新的蛋白藥物的定量。盡管LBA方法是目前生物分析方法的首要選擇，并且在可以預見的未來仍將如此，LC-MS/MS方法，由于其與生俱來的multiplexed的定量分析能力，可能會得到更加廣泛地應用，以支持雙特異性生物藥的PK評估。LC-MS/MS比LBA分析具有更少的分析變異性（variability）和關鍵試劑的可及性（availability）問題。預期分析實驗室的自動化將擴展到生物分析的所有階段，以減少人工錯誤和提高數據質量。特別聲明 本文如有疏漏和誤讀相關指南和數據的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經發(fā)表學術期刊、官方網絡報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。 參 考 文 獻1.Zhu, L, et al. 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2021-08-30
